Fische als „Avatare“ zum Testen von Behandlungen

Alles findet im ersten Stock der Champalimaud Foundation statt, auf einer Insel und einer Bank inmitten anderer laufender Projekte mit Blick auf den tropischen Garten zwischen Klinik und Laboren. An der Forschung ist ein zehnköpfiges Team beteiligt, darunter Brust- und Eierstockkrebsspezialisten sowie Informatiker, die sich mit dem ebenfalls dort entwickelten Algorithmus für künstliche Intelligenz befassen. Rita Fior ist die Namensgeberin des Labors und leitet das Projekt „zAvatar“ , eine Studie zur Entwicklung eines Modells, das die am besten geeignete Krebsbehandlung für den individuellen Tumor einer Person vorhersagt, ohne die Patienten mehreren „nutzlosen“ Therapien mit erheblichen Nebenwirkungen auszusetzen.

„Der Name des Projekts stammt von dem amerikanischen Forscher David Langer, den wir auch auf diesem Gebiet kennen. Damals nannten wir es Patient Derived Xenograft, PDX . Dann, ich weiß nicht warum, ich glaube, es war, als der Film [James Camerons „ Avatar “] herauskam, begannen die Leute, über Avatare zu reden“, erzählt die leitende Forscherin dem Observador und erklärt das Grundprinzip ihres Experiments – Tests „an einem Avatar“ statt direkt an einem Menschen . „Wir müssen das Produkt verkaufen, wir müssen die Wissenschaft verkaufen“, fährt sie fort. Im Juli erhielt das Team eine Förderung in Höhe von 100.000 Euro von der portugiesischen Liga gegen Krebs – die höchste Summe, die diese Organisation jemals vergeben hat.

Ob PDX oder zAvatar – der Name ist für Rita Fior nicht das Wichtigste. Ihr aktueller Schwerpunkt liegt auf der Verwendung von Zebrafischembryonen – die etwa 70 % ihrer Gene mit dem Menschen teilen –, um die Wirksamkeit verschiedener auf dem Markt erhältlicher Krebsbehandlungen bei Patienten mit fortgeschrittenem Brust- und Eierstockkrebs zu testen. Der Prozess selbst ist in der Theorie relativ einfach, die Umsetzung jedoch komplexer als es scheint. Die Spezialistin erklärt, dass alles mit der Entnahme von Tumorzellen von Patienten beginnt , parallel dazu werden diese Zebrafische in einer anderen Abteilung der Champalimaud-Stiftung gezüchtet.

Um zur Entbindungsstation zu gelangen, muss man in den Keller der Champalimaud-Stiftung hinabsteigen, einen Bereich, für den strenge Zugangsvorschriften gelten. Das Tragen von Schuhüberziehern, sterilem Kittel, Haarhaube, Mundschutz und Handschuhen ist Pflicht . Markierungen auf dem Boden markieren, wo man sich mit und ohne Schutz bewegen kann. Sobald man sich ausgerüstet hat, geht es einen langen Korridor entlang, dessen Türen sich automatisch öffnen, wenn man sich nähert. Er befindet sich auf Meereshöhe und verläuft parallel zum Tejo. Es gibt keine Fenster, aber in der Ferne sehen wir einen Raum, in dem diese Tiere gehalten werden.

In den vier Wänden, die Hunderte von Tanks beherbergen, kann man nun seine Gesichtsmaske abnehmen, alle anderen Schutzschichten bleiben jedoch an Ort und Stelle, um die verschiedenen Experimente, die gleichzeitig in diesem Raum stattfinden, in keiner Weise zu stören. Die offizielle Bezeichnung lautet Vivarium . Dabei handelt es sich um Räume, in denen verschiedene Tierarten für wissenschaftliche Zwecke in streng kontrollierten Umgebungen gezüchtet werden. In diesem speziellen Fall handelt es sich um etwa 30.000 Zebrabärblinge , die einzige Art, die in den vom Observer besuchten Einrichtungen vorkommt. In den benachbarten Räumen gibt es andere Meerestierarten und Mäuse, die in der betreffenden Studie nicht verwendet wurden.

Alle Bedingungen werden kontrolliert, von der Wassertemperatur und dem pH-Wert über die Beleuchtung im Raum bis hin zur Leitfähigkeit selbst , die schrittweise geändert wird, um die Fische auf die Renovierungsarbeiten vorzubereiten, die im August im Vivarium stattfinden. „Durch die Arbeiten werden Geräusche und Vibrationen entstehen, und wir rechnen mit [ihren Auswirkungen], die bei den Tieren Stress verursachen können“, erklärt Joana Monteiro, Leiterin der Fischplattform der Stiftung. Sie erwähnt, dass Zebrafische „eine sehr gute Fähigkeit besitzen, sich schrittweise an unterschiedliche Bedingungen anzupassen“, im Gegensatz zu potenziellen Krankheitserregern, die sich während dieser Zeit in den Becken festsetzen könnten. Zu diesem Zweck, so die Spezialistin weiter, wird dem überwiegend aus Süßwasser bestehenden Lebensraum der Fische auch etwas Salzwasser beigemischt, sodass sie die Veränderung problemlos verkraften können.

Es gibt drei Inseln, sechs Seiten mit diesen blauen Becken gefüllt. Bei voller Auslastung fasst jedes dieser kleinen Becken 35 erwachsene Zebrafische , doch viele sind nicht voll. Diese erwachsenen Tiere werden in der Regel zweimal täglich von Hand mit einem Krebstier namens Salzwassergarnelen gefüttert – mit Ausnahme einiger Versuchstiere, die drei- bis viermal täglich gefüttert werden und eine andere Ernährung als ihre Nachbarn erhalten. Die Insel im hinteren Teil des Raumes beherbergt die neu eingetroffenen „Larven“ aus der „Entbindungsstation“.

Diese Fische, die in größeren Mengen in den Becken verteilt werden können, werden auch anders behandelt als erwachsene Fische. Diese Wachstumsphase, der Übergang vom Embryo zum erwachsenen Tier, dauert etwa drei Monate. Während dieser Zeit fressen die „Babys“ und „Kinder“ viermal täglich – zweimal Flüssignahrung, zweimal Pulvernahrung –, allerdings in einem „halbautonomen“ Regime. Anders als die erwachsenen Fische, die von den Technikern der Plattform gefüttert werden, werden die „Larven“ von einem Roboter gefüttert , der in den Becken angebrachte QR-Codes liest und Informationen über die Anzahl der vorhandenen Fische und das benötigte Futter übermittelt.

„Trockenfutter ist das, was sie täglich fressen. Die Bereitstellung von Lebendfutter ist eine gute Bereicherung der Umwelt, da sie so ihren natürlichen Jagdinstinkt bewahren kann , was wiederum gut für die Fische selbst ist, nicht nur für ihre Gesundheit, sondern auch für die Aufrechterhaltung normaler neurologischer Reaktionen“, erklärt Joana Monteiro und weist darauf hin, dass diese „Bereicherung der Umwelt“ auch zum „Glück“ der Fische beiträgt.

Laut dem Leiter der Plattform gibt es auf den drei Inseln des Vivariums „etwa 300 genetisch veränderte Linien “. „Es sind alles Zebrafische“, doch beim Betreten des Raumes fallen deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Fischen auf: „Manche haben gestreifte Pigmente, andere sind rosa.“ Die Streifen ähneln denen eines Zebras, daher der Name dieser Art. Einige wurden jedoch mit einer Mutation gezüchtet, die die Bildung schwarzer Pigmente verhindert, was zu einer einheitlichen Farbe ohne die für den Fisch typischen Streifen führt.

Diese ästhetische Differenzierung ist aus verschiedenen experimentellen Gründen äußerst wichtig . Oft haben Männchen eine Farbe, Weibchen eine andere, oder sogar innerhalb desselben Experiments, in zwei verschiedenen Zelllinien, dient dieser Pigmentwechsel der leichteren Identifizierung. Während der Fortpflanzung ist dieses Phänomen deutlicher sichtbar, insbesondere weil Männchen und Weibchen im selben Becken getrennt leben.

Die Fische werden in getrennte Behälter gesetzt, die durch eine Trennwand getrennt sind – die Männchen auf der einen Seite, die Weibchen auf der anderen –, sodass die Forscher den Vorgang vollständig kontrollieren und genau wissen, wann die Eier abgelegt werden . „Wenn es dunkel wird, wird das Licht ausgeschaltet und niemand betritt den Raum. Erst tagsüber, gegen acht Uhr morgens, wird das Licht wieder eingeschaltet und mit dem Reiz, der anzeigt, dass es Tag ist, beginnt der [Fortpflanzungs-]Prozess“, erklärt Joana Monteiro und weist darauf hin, dass die Forscher zu diesem Zeitpunkt beginnen, diese ausgewählten Fische zu beobachten, um die Paarung zu beobachten. „ Das Männchen klopft mit seinem Schwanz auf den Bauch des Weibchens und gibt dann die Eier frei “, fährt sie fort.

Normalerweise fressen Zebrafische oft einen Teil ihrer eigenen Eier, nachdem diese vom Weibchen gelegt wurden. Um diesen Reiz zu bekämpfen, wird ein Netz angebracht, durch das die Eier in eine für die Fische unzugängliche Trennwand gelangen und so das Überleben aller Nachkommen sichergestellt wird. Jedes Paar kann zwischen 100 und 200 Eier gleichzeitig produzieren – manchmal sogar bis zu 500. Am Boden dieser Zuchtbecken werden Steinabbildungen – ähnlich ihrem natürlichen Lebensraum – „als Bereicherung während der Brutzeit“ verwendet . Es gibt zwar keine Beweise dafür, dass dies „definitiv besser“ sei, aber es gibt „Hinweise“ darauf, dass es vorteilhaft ist.

Um die frisch geschlüpften Embryonen zu besichtigen, muss man in einen anderen Raum gehen, der nur wenige Schritte entfernt ist, und daher die Maske erneut aufsetzen. Dieser zweite Raum besteht aus zwei Bänken mit Fluoreszenzmikroskopen und Inkubatoren, in denen die Embryonen aufbewahrt werden. In diesem Raum werden zusätzliche Screenings durchgeführt, um gewünschte genetische Veränderungen zu identifizieren. In diesem Raum bleiben sie auch, bis sie offiziell als Tiere eingestuft werden . „Nach fünf Tagen beginnen sie, extern zu fressen, und dies ist auch das gesetzliche Alter, in dem sie gemäß dem Gesetz zum Schutz von Wirbeltieren, die für Experimente verwendet werden, als Tiere geschützt werden“, fährt der Spezialist während des Besuchs bei Observador fort und erklärt, dass die Fische während dieser Zeit, bis sie in die „Mutterschaftsphase“ eintreten, von dem „Dotter“ unter ihrem Kopf leben, der durch den Verzehr schrumpft – bis sie den Punkt erreichen, an dem sie extern fressen können.

Zurück im Büro der Projektleiterin „zAvatar“ mit Blick auf den Tejo erklärt Rita Fior, warum sie sich auf Zellen von Brust- und Eierstockkrebspatientinnen konzentrieren. „Bei diesen Krebsarten sammeln sich oft Flüssigkeiten an, die den Patientinnen zur Linderung der Symptome entnommen werden müssen, dann aber im Müll landen“, erklärt die Forscherin und fügt hinzu, dass „diese Flüssigkeiten viele Tumorzellen enthalten“. Um die Anzahl der Eingriffe zu reduzieren, verwendet die Forschungsgruppe daher dieses „Material, das den Patientinnen ohnehin entnommen worden wäre“, was neben ethischen Bedenken auch zu geringeren Operationskosten führt .

Sobald die erforderlichen Proben entnommen wurden, wird im nächsten Schritt das Krebsmaterial Zebrafisch-„Larven“ oder Embryonen verabreicht , die den Tumor rasch assimilieren und so eine Beobachtung des Krebsverlaufs in kürzester Zeit ermöglichen. So können therapeutische Verfahren an den Fischen getestet werden. „Wir verwenden diese Art von Tumorzellen auch deshalb, weil in diesem Zusammenhang, wenn der Krebs weit fortgeschritten und metastasiert ist, mehrere Therapieoptionen zur Verfügung stehen“, erklärt Rita Fior. Sie weist darauf hin, dass gerade in diesen Fällen die größte Unsicherheit in der klinischen Praxis herrscht und die Patienten oft mehreren Behandlungsrunden unterzogen werden, die nicht den gewünschten Erfolg bringen, bis die am besten geeignete Option gefunden ist .

„Wir testen [die therapeutischen Optionen], die den Ärzten zur Verfügung stehen“, fährt er fort und erwähnt, dass sie auf diese Weise den Patienten von Anfang an von allen Nebenwirkungen befreien können, die mit den verschiedenen eingesetzten Therapien verbunden sind, ohne dass der gewünschte therapeutische Effekt eintritt, da sie im Voraus wissen, welche Behandlung für die spezifische Krebsart jedes Einzelnen auf personalisierte Weise am wirksamsten ist.

Die „Larven“ sind mit bloßem Auge kaum zu erkennen. Um ihre Zellen zu manipulieren, sei es bei der Krebsbehandlung oder bei Therapien, verwenden Forscher hochspezialisierte Lupen und Mikroskope. „Ohne Immunfluoreszenz können wir sie nicht sehen“, erklärt Forscherin Bruna Costa, während sie dem Observador die Bilder auf dem Computerbildschirm erklärt, der an ein kostengünstiges Konfokalmikroskop für rund 250.000 Euro angeschlossen ist. Dieses Gerät hat eine höhere Auflösung als alle anderen im Labor – trotz „anderer, teurerer Geräte am Institut“ –, was eine Einzelzellauflösung , individualisierte Zellen und bessere Rückschlüsse auf die Wirkung von Behandlungen ermöglicht.

Auf der anderen Seite der Bank, wo sich die „einfacheren“ Lupen mit niedrigerer Auflösung befinden, erklärt Co-Leiterin Marta Estrada, dass dort „Agarplatten“ verwendet werden, eine Art Gelatine, die zur „Ausrichtung der Fische“ und zur Erleichterung der Medikamentenverabreichung dient, da sie alle in einer einzigen „Linie“ zusammengefasst sind. Betrachtet man das Bild der Fluoreszenzlupe neben dem „Super“-Konfokalmikroskop, kann man noch immer den lebenden Embryo mit seinem schlagenden Herzen sehen .

„Laser sind giftig. Wenn wir also zehn Stunden lang einen sehr starken Laser auf den Fisch richten, entsteht eine Toxizität“, fährt die Forscherin Marta Estrada fort und erklärt, dass die Eigenschaft der „ Spinning Disks “ – rotierende Scheiben, die die schnelle Aufnahme mehrerer Bilder aus verschiedenen Positionen ermöglichen – in diesem „Supermikroskop“ eine deutliche Reduzierung der Toxizität ermöglicht und so „spektakuläre“ Beobachtungen ermöglicht.

„Wir machen hier unglaubliche Videos. Die lebenden Fische werden die ganze Nacht – 10, 12 Stunden – beobachtet, und wir beobachten, wie ihr Immunsystem mit den Tumorzellen interagiert , wie sie Metastasen bilden usw. Bei Mäusen ist das nicht möglich, da sie viel größer und nicht so durchsichtig sind wie Larven“, fügt er hinzu. Bei Mäusen, besser bekannt als Laborratten, würde derselbe Prozess „Monate dauern“ und wäre komplexer zu überwachen, da mehrere Eingriffe an den Tieren erforderlich wären. Daher dauert der gesamte Prozess nur 10 Tage – von der Geburt des Fisches bis zum endgültigen Ergebnis hinsichtlich der wirksamsten Behandlung im jeweiligen Fall.

Pro Behandlung wird nicht nur ein Embryo verwendet, erklärt Forscherin Raquel Mendes , während sie die Fische von einem Objektträger entnimmt, um sie später zu untersuchen. „Wir verwenden alles, was wir aus der Patientenprobe finden können, und injizieren alles in unsere Fische“, sagt sie und weist darauf hin, dass „viele während der Therapie sterben“ und dass es manchmal bei der Verabreichung des Medikaments nicht gelingt, „die Fische an der richtigen Stelle zu injizieren“, was zum „Verlust von Fischen“ führt.

Gerade weil es während des Prozesses so viele Verluste gibt, betont die Forscherin die Notwendigkeit, „viele Fische zur Verfügung zu haben, um sie in Kontrollgruppen sowie Therapie A, Therapie B, Therapie C usw. aufzuteilen.“ Raquel Mendes fügt hinzu, dass es nicht nur wichtig sei, mindestens ein schlüssiges Ergebnis sicherzustellen, sondern auch besser sei, eine große Anzahl Fische zur Verfügung zu haben, um den Ärzten zu beweisen, dass die erzielten Ergebnisse signifikant sind und eine größere „statistische Sicherheit“ haben.

Angesichts des erheblichen Potenzials dieser Methode laufen Kooperationen mit anderen Institutionen und Forschern aus zahlreichen Ländern, sei es, um tiefer in die Entwicklungsthemen einzudringen oder einfach, um anderen Laboren „die Tricks beizubringen“.

„Wir haben mehrere Kooperationsprojekte erhalten, bei denen Studierende hierherkommen, um zu lernen“, sagt Projektleiterin Rita Fior. Die Initiative geht auf ein europäisches Projekt zurück, das die Studie finanziert und es Forschern eines serbischen Labors ermöglicht, nach Lissabon zu reisen, um die Techniken des Teams der Champalimaud-Stiftung zu erlernen. „Letztes Jahr haben wir einen einwöchigen Kurs mit acht Studierenden aus aller Welt abgehalten – einer kam aus Indien, ein anderer aus Chile – und sie kamen nur hierher, um zu lernen“, erinnert sie sich. „Es geht um viele Tricks. Es scheint einfach, ist es aber nicht“, fügt sie hinzu.

Neben den lernbegierigen internationalen Studierenden gibt es auch eine starke interinstitutionelle Zusammenarbeit. Bestes Beispiel dafür ist die kleine Unterabteilung des Teams, die sich ausschließlich der Entwicklung des Algorithmus für künstliche Intelligenz widmet. Ihr Hauptziel ist es, die Gesamtprozesszeit von zehn auf fünf oder sechs Tage zu verkürzen.

Dieses Unterteam besteht aus zwei Mitgliedern: Estibaliz Gómez-de-Mariscal , einer spanischen Forscherin am ITQB, und Martim Gamboa. Als Masterstudent an der Fakultät für Naturwissenschaften und Technologie der NOVA-Universität Lissabon fungiert er als Brücke zwischen den Laboren in Oeiras und Champalimaud. „Martim ist unser IT-Spezialist; er kümmert sich um die KI“, erklärt Rita Fior.

Dieser Teil des Projekts hatte mehrere Anfänge, die alle auf Hindernisse stießen, sei es aufgrund persönlicher Einschränkungen der Experten oder der Ineffektivität der entwickelten Algorithmen. Das letzte Testjahr war jedoch äußerst vielversprechend, so sehr, dass das Projekt am 20. Juni von der portugiesischen Liga gegen Krebs mit einem Forschungsstipendium in Höhe von 100.000 Euro ausgezeichnet wurde – der höchsten jemals von der Organisation vergebenen Geldsumme .

„Diese Forschung stellt einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der personalisierten Onkologie dar, indem sie innovative biologische Modelle mit künstlicher Intelligenz kombiniert, um die Identifizierung wirksamer, an das Profil jedes einzelnen Patienten angepasster Therapien zu beschleunigen “, betonte die Organisation in einer Erklärung an die Redaktionen und merkte an, dass dieser Zuschuss „Onkologieforschung im Zeitalter der künstlichen Intelligenz“ einen „Meilenstein in ihrer Geschichte“ darstelle, nicht nur wegen seines Werts, sondern auch wegen seines Ziels, „herausragende wissenschaftliche Projekte zu unterstützen, die Onkologieforschung mit dem Potenzial künstlicher Intelligenz kombinieren, um die Gesundheitsversorgung, die Frühdiagnose und personalisierte Behandlungen zu verbessern.“

In etwas mehr als einem Jahr könne der aktuelle Prototyp bereits Annäherungen von etwa 70 bis 80 Prozent der manuellen Methodik erreichen , erklärt Martim Gamboa gegenüber Observador. Trotz der Erwartung einer „robusteren und schnelleren“ Automatisierung der Ergebnisanalyse mit den entwickelten KI-Tools weisen die Projektverantwortlichen darauf hin, dass für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse stets eine menschliche Qualitätskontrolle erforderlich sein wird.

Das Stipendium hat eine Laufzeit von zwei Jahren . Mit Beginn der klinischen Tests betont Rita Fior, wie wichtig die in diesem Zeitraum gewonnenen Daten für die Weiterentwicklung des Algorithmus sein werden.

Für den Erfolg dieser Forschung sei es entscheidend, erklärt Rita Fior, dass neben der Erläuterung des Versuchsprozesses auch eine Reihe von Kriterien erfüllt sein müssen, um die Genehmigung für den Einsatz dieser Tiere in einem wissenschaftlichen Kontext zu erhalten. Die europäische Richtlinie, die diese Praxis regelt, basiert auf den drei R. Nicht auf dem traditionellen „Recycling, Erneuerung und Wiederverwendung“, sondern auf „Ersatz, Reduzierung und Verfeinerung“.

So verlangt die Europäische Union, dass Forscher vor der Genehmigung prüfen, ob sie den Einsatz von Tieren in ihren Projekten durch andere Methoden oder Ansätze „ersetzen“ können, die diesen nicht erfordern. Ebenso erfordert die Reduzierung den Einsatz der geringstmöglichen Anzahl von Tieren. Laut dem Umweltportal des EU-Rechts wird unter Verfeinerung verstanden, „alle Verfahren von der Geburt eines Tieres bis zu seinem Tod zu ändern, um sein Leiden zu minimieren und sein Wohlergehen zu verbessern“.

Diese Regelung, die auf höchster europäischer Ebene umgesetzt wird, wird auch intern, bei der Champalimaud-Stiftung selbst, berücksichtigt. „Aus rechtlicher Sicht ist alles, was wir hier tun, stark reglementiert. Alle Forscher, deren Projekte von der Tierschutzbehörde genehmigt werden, müssen intern zugelassen werden “, sagt Joana Monteiro, Leiterin der Fischplattform des Instituts, die auch die Genehmigung der Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke koordiniert.

Vor der Genehmigung muss die Plattform prüfen, „warum mit Tieren gearbeitet wird“, „zu welchem Zweck“ und „ob das Projekt ohne Tieropfer fortgeführt werden kann“. Nach interner Genehmigung wird der Antrag an die Generaldirektion für Lebensmittel- und Veterinärwesen (DGAV) weitergeleitet, die die endgültige Genehmigung nach europäischen Kriterien erteilt. Die intern verwaltete Plattform ist jedoch dafür verantwortlich, dass die Forschung nicht von den Vorschriften abweicht. „Die technische Seite wird auch während der experimentellen Arbeit überwacht“, räumt Joana Monteiro ein und weist darauf hin, dass sie Forscher regelmäßig zu bewährten Praktiken im Umgang mit Tieren in der Forschung berät.

Die Verantwortliche erklärt gegenüber dem Observador, dass sie noch nie ein Projekt dieser Art ablehnen musste. „Wir können höchstens über die Anzahl der Tiere diskutieren, darüber, ob sie reduziert oder nur halbiert werden können, ob ein anderer Ansatz, auch in der experimentellen Methode, möglich ist“, fährt sie fort, versichert aber, dass „Forscher sich bereits bewusst sind“, dass sie auf den Einsatz von Tieren verzichten müssen, wenn dies nicht unbedingt notwendig ist . Im Fall des „zAvatar“-Projekts gab es tatsächlich keine andere Alternative, und dennoch garantiert Projektleiterin Rita Fior, dass jeder Schritt mit größtmöglicher Menschlichkeit durchgeführt wird .

„Wenn wir [die Tumorzellen] injizieren, werden die Fische betäubt und bewegen sich erst nach einiger Zeit unter der Wirkung des Narkosemittels vorwärts. Wir kümmern uns sehr gut um sie“, versichert die Forscherin, was mit den Anweisungen von Joana Monteiro übereinstimmt: „Zuerst nehmen sie ein Ben-u-ron – die Fischvariante –, dann die Narkose, und erst danach wird der Eingriff durchgeführt . Und dann nehmen sie zur Erholung ein weiteres Schmerzmittel.“

Rita Fior betont, dass die in ihrem Labor verwendeten Embryonen technisch gesehen nicht als Tiere gelten, da sie vor dem von der Europäischen Union geforderten Alter von fünf Tagen verwendet werden. Trotz dieser Grauzone in den Richtlinien versichert die Forscherin, dass sie , „unabhängig davon, ob sie als Tiere gelten oder nicht“, stets „einer Reihe von Vorsichtsmaßnahmen unterzogen werden, um das Leiden der Tiere zu minimieren“.